课程首页课程介绍教学大纲电子资源双语教学实践教学激励之源学术交流友情链接联系我们
 当前位置:课程首页新闻频道教学资源电子讲义

电子讲义- 第四章 微生物的生长和环境条件

[ 推荐:★★★☆☆┋作者:未知┋来源:未知┋发布:admin┋发布:2009年1月1日┋阅读:1609次 ]

第四章 微生物的生长和环境条件

第一节 微生物的分离和纯培养

在微生物学中,在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture),而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pure culture)。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果,因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。

一、无菌技术

微生物通常是肉眼看不到的微小生物,而且无处不在。因此,在微生物的研究及应用中,不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物,而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”,防止其他微生物的混入。在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术被称为无菌技术(aseptictechnique),它是保证微生物学研究正常进行的关键。

微生物培养的常用器具及其灭菌:试管、玻璃烧瓶、平皿(culture dish,petri dish)等是最为常用的培养微生物的器具,在使用前必须先行灭菌,使容器中不含任何生物。培养微生物的营养物质[称为培养基(culture medium)]可以加到器皿中后一起灭菌,也可在单独灭菌后加到无菌的器具中。最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌,它可以杀灭所有的生物,包括最耐热的某些微生物的休眠体,同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌,特别是空气中的杂菌污染,试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口,通常采用棉花塞,也可采用各种金属、塑料及硅胶帽,它们只可让空气通过,而空气中的其他微生物不能通过。而平皿是由正反两平面板互扣而成,这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。

接种操作:用接种环或接种针分离微生物,或在无菌条件下把微生物由一个培养器皿转接到另一个培养容器进行培养,是微生物学研究中最常用的基本操作。由于打开器皿就可能引起器皿内部被环境中的其他微生物污染,因此微生物实验的所有操作均应在无菌条件下进行,其要点是在火焰附近进行熟练的无菌操作,或在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行操作。操作箱或操作室内的空气可在使用前一段时间内用紫外灯或化学药剂灭菌。有的无菌室通无菌空气维持无菌状态。

用以挑取和转接微生物材料的接种环及接种针,一般采用易于迅速加热和冷却的镍铬合金等金属制备,使用时用火焰灼烧灭菌。而转移液体培养物可采用无菌吸管或移液枪。

二、获得纯培养的方法

纯培养:微生物学把从一个细胞或同一个细胞群繁殖得到的子代,称纯培养或纯种。

纯培养的类型:菌种纯(菌落纯)----是分离菌落而得到的;

菌株纯(细胞纯):是分离单个细胞得到的。

(一)用固体培养基分离纯培养

不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征,可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌,以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落,采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板,即培养平板(culture plate)的简称,它是指熔化的固体培养基倒入无菌平皿,冷却凝固后,盛有固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基是用琼脂或其他凝胶物质固化的培养基,每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落,形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Koch建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行,100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。

稀释倒平板法(pour plate method)(混菌法):先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10000…),使样品中的微生物细胞充分分散,然后分别取不同稀释液少许,与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合,摇匀后,倾入灭过菌的培养皿中,待琼脂凝固后,制成可能含菌的琼脂平板,保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当,在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。[菌落纯]

涂布平板法(spread platemethod)由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡,而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长,因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面,经培养后挑取单个菌落

平板划线分离法(streak plate method)P87用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来,如果划线适宜的话,微生物能一一分散,经培养后,可在平板表面得到单菌落。

稀释摇管法(dilutlon shake culture method)用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡,可以来用通常的方法制备平板,然后置放在封闭的容器中培养,容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物,纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行,它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右,将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释,试管迅速摇动均匀,冷凝后,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物,将培养基和空气隔开。培养后,菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植,需先用一只灭菌针将液体石蜡—石蜡盖取出,再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间,吹入无菌无氧气体,将琼脂柱吸出,置放在培养皿中,用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。

二)用液体培养基分离纯培养

对于大多数细菌和真菌,用平板法分离通常是满意的,因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长,例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等,这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。

通常采用的液体培养基分离纯化法是稀释法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释,以得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了,得到纯培养物的概率就会急剧下降。因此,采用稀释法进行液体分离,必须在同一个稀释度的许多平行试管中,大多数(一般应超过95%)表现为不生长。

(三)单细胞(单孢子)分离

稀释法有一个重要缺点,它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类,而在自然界,很多微生物在混杂群体中都是少数。这时,可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养,称为单细胞()分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比,较大的微生物如藻类、原生动物较容易,个体很小的细菌则较难。

对于较大的微生物,可采用毛细管提取单个个体,并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次,除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜,如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物,需采用显微操作仪,在显微镜下进行。目前,市场上有售的显微操作仪种类很多,一般是通过机械、空气或油压传动装置来减小手的动作幅度,在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时,也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离,例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察,选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求,多限于高度专业化的科学研究中采用。

(四)选择培养分离

没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中一切生物生长的要求,在一定程度上所有的培养基都是选择性的迄今,能培养的微生物1%,不可培养的99%。在一种培养基上接种多种微生物,只有能生长的才生长,其他被抑制。如果某种微生物的生长需要是已知的,也可以设计一套特定环境使之特别适合这种微生物的生长,因而能够从自然界混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来,即使在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离,是十分重要的,特别对于从自然界中分离、寻找有用的微生物。在自然界中,除了极特殊的情况外,在大多数场合下微生物群落是由多种微生物组成的。因此,要从中分离出所需的特定微生物是十分困难的,尤其当某一种微生物所存在的数量与其他微生物相比非常少时,单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生物的。例如,若某处的土壤中的微生物数量在108时,必须稀释到10-6才有可能在平板上分离到单菌落,而如果所需的微生物的数量仅为102-103,显然不可能在一般通用的平板上得到该微生物的单菌落。要分离这种微生物,必须根据该微生物的特点,包括营养、生理、生长条件等,采用选择培养分离的方法。或抑制使大多数微生物不能生长,或造成有利于该菌生长的环境,经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升,再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。

利用选择培养基进行直接分离:主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件,有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时,可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板,微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素,在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选,可以减少工作量,将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰;再如,要分离高温菌,可在高温条件进行培养;要分离某种抗生素抗性菌株,可

在加有抗生素的平板上进行分离;有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行,可以利用它们的滑动特点进行分离纯化,因为滑行能伎它们自己和其他不能移动的微生物分开,可将微生物群落点种到平板上,让微生物滑行,从滑行前沿挑取接种物接种,反复进行,得到纯培养物。

富集培养:主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同,制定特定的环境条件,使仅适应于该条件的微生物旺盛生长,从而使其在群落中的数量大大增加,人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择,如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。例,采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸(ρ-hydroxybezyl acid)的微生物的实验过程:首先配制以对羟基苯甲酿为唯一碳源的液体培养基并分装于烧瓶中,灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中,培养一定时间,原来透明的培养液会变得浑浊,说明已有大量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养,该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中特大大提高,将培养掖涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板,得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养,其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长,而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长,说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物。

通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后,可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。

富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之一。营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要。富集培养方法提供了按照意愿从自然界分离出特定已知微生物种类的有力手段,只要掌握这种微生物的特殊要求就行。富集培养法也可用来分离培养出由科学家设计的特定环境中能生长的微生物,尽管我们并不知道什么微生物能在这种特定的环境中生长。

(五)二元培养物

分离的目的通常是要得到纯培养。然而,在有些情况下这是做不到的或是很难做到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。只有一种微生物的培养物称为纯培养物,含有二种以上微生物的培养物称为混合培养物,而如果培养物中只含有二种微生物,而且是有意识地保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径,因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物。有一些具有细胞的微生物也是严格的其他生物的细胞内寄生物,或特殊的共生关系。对于这些生物,二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。

在自然环境中,猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养,培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成,例如,纤毛虫、变形虫和粘菌。对这些生物,二者的关系可能并不是严格的。这些生物中有些能够纯培养,但是其营养要求往往极端复杂,制备纯培养的培养基很困难、很费事。

第二节 微生物的群体生长

微生物(个体)生长是细胞物质有规律地、不可逆增加,导致细胞体积扩大的生物学过程。

繁殖是微生物生长到一定阶段,由于细胞结构的复制与重建并通过特定方式产生新的生命个体,即引起生命个体数量增加的生物学过程。可以看出微生物的生长与繁殖是两个不同,但又相互联系的概念。生长是一个逐步发生的量变过程,繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开,但在低等特别是在单细胞的生物里,由于个体微小,这两个过程是紧密联系很难划分的过程。因此在讨论微生物生长时,往往将这两个过程放在一起讨论,这样微生物生长又可以定义为在一定时间和条件下细胞数量的增加,这是微生物群体生长的定义。

一、细菌的群体生长繁殖

除某些真菌外,我们肉眼看到或接触到的微生物已不是单个,而是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种,接种后的生长是微生物群体繁殖生长

(一)分批培养中细菌的群体生长繁殖

分批培养:是采用完全封闭的容器,一次接种,一性加入培养基进行培养的方法,是实验室培养微生物最常用的方法。细菌接种到均匀的液体培养基后,当细菌以二分裂法繁殖,分裂后的子细胞都具有生活能力。在不补充营养物质或移去培养物,保持整个培养液体积不变条件下,以时间为横坐标,以菌数为纵坐标,根据不同培养时间里细菌数量的变化,可以作出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线,这种曲线称为生长曲线(growth cuwe)。一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。

  • 迟缓期(lag phase)

细菌接种到新鲜培养基而处于一个新的生长环境,因此在一段时间里并不马上分裂,细菌的数量维持恒定,或增加很少。此时胞内的RNA、蛋白质等物质含量有所增加,相对地此时的细胞体积最大,说明细菌并不是处于完全静止的状态。产生迟缓期的原因,认为是微生物接种到一个新的环境,暂时缺乏足够的能量和必需的生长因子,“种子”老化(即处于非对数生长期)或末充分活化,接种时造成的损伤等。

在工业发酵和科研中迟缓期会增加生产周期而产生不利的影响,但是迟缓期无疑也是必需的,因为细胞分裂之前,细胞各成分的复制与装配等也需要时间,因此应该采取一定的措施:①通过遗传学方法改变种的遗传特性使迟缓期缩短;②利用对数生长期的细胞作为“种子”;③尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大;④适当扩大接种量等方式缩短迟缓期,克服不良的影响。

  • 对数生长期(log Phase)

又称指数生长期(exponential phase)。细菌经过迟缓期进入对数生长期,并以最大的速率生长和分裂,导致细菌数量呈对数增加,而且细菌内各成分按比例有规律地增加,很明显,此时期内的细菌生长是平衡生长。对数生长期细菌的代谢活性、酶活性高而稳定,大小比较一致,生活力强,因而它广泛地在生产上用作“种子”和在科研上作为理想的实验材料。[生产上如以获菌体为目的,该期最好]

  • 稳定生长期(stationary phase)

由于营养物质消耗,代谢产物积累和pH等环境变化,逐步不适宜于细菌生长,导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量),结束对数生长期,进入稳定生长期。稳定生长期的活细菌数最高并维持稳定。如果及时采取措施,补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件,如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等可以延长稳定生长期,获得更多的菌体物质或代谢产物。(生产上如以获代谢 产物为目的,该期最好)

  • 衰亡期(declinedeath phase)

营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累,细菌死亡速率逐步增加和活细菌逐步减少,标志进入衰亡期。该时期细菌代谢活性降低,细菌衰老并出现自溶。该时期死亡的细菌以对数方式增加,但在衰亡期的后期,由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低。

此外,不同的微生物,甚至同一种微生物对不同物质的利用能力是不同的。有的物质可直接被利用(例如葡萄糖或NKf等);有的需要经过一定的适应期后才能获得利用能力(例如乳糖或N03-等)。前者通常称为速效碳源(或氮源),后者称为迟效碳源(或氮源)。当培养基中同时含有这两类碳源(或氮源)时,微生物在生长过程中会产生二次生长现象。

(二)连续培养P94-97

连续培养(continous culture of microorganisms)是在微生物的整个培养期间,通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。根据生长曲线,营养物质的消耗和代谢产物的积累是导致微生物生长停止的主要原因。因此在微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。

最大优点:①微生物能在比较恒定的生长条件下以恒定的生长速度生长;②缩短生长周期,提高生产设备的利用率,降低产品成本。

缺点:①营养物质的利用率低;②感染杂菌的机会增多;③菌体易老化,衰退。

二、微生物群体生长的测定(只要求掌握计数法,其余的可自学)

微生物生长情况可以通过测定单位时间里微生物数量或生物量(biomass)的变化来评价。通过微生物生长的测定可以客观地评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响,或评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果,或客观地反映微生物生长的规律。因此微生物生长的测量在理论上和实践上有着重要的意义。微生物生长的测定有计数、重量和生理指标等方法。

一)计数法

此法通常用来测定样品中所含细菌、孢子、酵母菌等单细胞微生物的数量。计数法又分为直接计数和间接计数两类。

  • 直接计数

这类方法是利用特定的细菌计数板或血球计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。此法的缺点不能区分死菌与活菌。计数板是一块特制的载玻片,上面有一个特定的面积l mm2和高0.1mm的计数室,在1mm2的面积里又被刻划成25个(或16个)中格,每个中格进—步划分成16个(或25个)小格,但计数室都是由400个小格组成。

将稀释的样品滴在计数板上,盖上盖玻片,然后在显微镜下计算4-5个中格的细菌数,并求出每个小格所含细菌的平均数,再按下面公式求出每毫升样品所含的细菌数。

每毫升原液所含细菌数=每小格平均细菌数×400×l000×稀释倍数

  • 间接计数法

  此法又称活菌计数法,其原理是在高稀释度下,微生物细胞充分分散,成单个细胞存在,每一个活的单细胞均能繁殖形成一个菌落,因而可用平皿培养的方法使每个活细胞生长并形成一个单独的菌落,通过统计长出的菌落数来推算待测样品中的活菌数。具体做法:将待测样品经一系列10倍稀释,然后选择三个稀释度的菌液,再采作用混菌法或涂布法来进行测数。但在实际操作中难以做到使所有细胞完全分开,即不能保证每个菌落都是由单项式个细胞分裂而来,所以现在多用菌落形成单位(CFU:colony forming units)来表示。

此法可因操作不熟练造成污染,或因培养基温度过高损伤细胞等原因造成结果不稳定。尽管如此,由于该方法能测出样品中微量的菌数,仍是教学、科研和生产上常用的一种测定细菌数的有效方法。土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含细菌、酵母、芽孢与孢子等的数量均可用此法测定。但不适于测定样品中丝状体微生物,例如放线菌或丝状真菌或丝状蓝细菌等的营养体等。

除上述两种常用的计数方法外,还有膜过滤法、比浊法。膜过滤法(测活菌数是当样品中菌数很低时,可以将一定体积的潮水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色(活菌指示剂,国外采用),并经处理使膜透明,再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数;比浊法(测总菌数原理是在一定范围内,菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比,即与光密度成正比,菌越多,光密度越大。因此可以借助于分光光度计,在一定波长下,测定菌悬液的光密度,以光密度(optical density,即O..D.)表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内,否则不准确。微生物计数法,发展迅速,现有多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法。

(二)重量法

1、测定菌体湿重或干重法

此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来,经洗涤,再离心后直接称重,求出湿重,如果是丝状体微生物,过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水,再称重求出湿重。不论是细菌样品还是丝状菌样品,可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内,于105℃烘干至恒重,取出放人干燥器内冷却,再称量,求出微生物干重

如果要测定固体培养基上生长的放线菌或丝状真菌,可先加热至50℃,使琼脂熔化,过滤得菌丝体,再用50℃的生理盐水洗涤菌丝,然后按上述方法求出菌丝体的湿重或干重。

2、蛋白质或DNA含量测定法

除了干重、湿重反映细胞物质重量外,还可以通过测定细胞中蛋白质或DNA的含量反映细胞物质的量。蛋白质是细胞的主要成分,含量也比较稳定,其中氮是蛋白质的重要组成元素。从一定体积的样品中分离出细胞,洗涤后,按凯氏定氮法测出总氮量。蛋白质含氮量为16%,细菌中蛋白质含量占细菌干物重的50%一80%,一般以65%为代表,有些细菌则只占13%一14%,这种变化是由菌龄和培养条件不同所产生的。因此总含氮量与蛋白质总量之间的关系可按下列公式计算:

蛋白质总量=含氮量×6.25

细胞总量=蛋白质总量÷(50%~80%(或65%))≈蛋白质总量×1.54

核酸DNA是微生物的重要遗传物质,每个细菌的DNA含量相当恒定,平均为8.4×10-5ng。因此从一定体积的细菌悬液中所含的细菌中提取DNA,求得DNA含量,再计算出这一定体积的细菌悬液所含的细菌总数。

(三)生理指标法

对于一些非真溶液的样品,要测定微生物数量除了用活菌计数法外,还可以用生理指标测定法进行测定。生理指标包括微生物的呼吸强度、耗氧量、酶活性、生物热等。这是根据微生物在生长过程中伴随出现的这些指标,样品中微生物数量多或生长旺盛,这些指标愈明显,因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量热计等设备来测定相应的指标。这类测定方法主要用于科学研究,分析微生物生理活性等。

第三节 微生物生长的环境因素

  • 温度

(一)微生物生长的温度范围

点击在新窗口中打开图片  不同微生物对温度的要求不同,各种微生物都有其生长繁殖的最低、最高、最适生长温度(又称三基点温度)。在微生物生长的温度范围内,随着温度的升高,微生物的活力及酶活力增强。

注意:最适的生长繁殖温度不一定是微生物代谢的最适温度。eg.青霉素产生菌---产黄青霉虽在30℃时生长最快,而青霉素产生的最适温度则在20-25℃。

(二)微生物的温度类型

微生物生长的温度类型

微生物类型

生长温度范围(

分布的主要场所

最低

最适

最高

低温型

专性嗜冷

兼性嗜冷

-12

-5-0

5-15

10-20

15-20

25-30

两极地区

海水及食品﹡冷藏室

中温型

10-20

25-40

40-50

哺乳动物生活环境

高温型

嗜热

极端嗜热

30

30

45-60

70-90

70以上

100以上

堆肥和沼气发酵池

温泉的洋底火山口

注:中温型有的还分为室温型、体温型两类。

  冷藏食品的变质往往是低温型微生物作用的结果。

(三)温度在微生物工作中的应用

1、利用高温致死温度灭菌(见培养基的灭菌)

致死温度:通常把能在10min.内杀死某种微生物的高温界限。大多数细菌、病毒、酵母菌和丝状真菌营养体的致死温度是50-65℃,放线菌和真菌孢子的抗热能力稍强,致死温度为75-80℃;细菌的芽孢抗热能力极强,能耐100℃以上的高温。

2、低温保藏菌种

通过分离纯化得到的微生物纯培养物,还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡,不会被其他微生物污染,不会因发生变异而丢失重要的生物学性状,否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。菌种或培养物保藏是一项最重要的微生物学基础工作,微生物菌种是珍贵的自然资源,具有重要意义。许多国家都设有相应的菌种保藏机构,例如,中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM),中国典型培养物保藏中心(CCTCC),美国典型菌种保藏中心(ATCC),美国的北部地区研究实验室(NRRL),荷兰的霉菌中心保藏所(CBS)。英国的国家典型菌种保藏中心(NCTC)以及日本的大阪发酵研究所(IFO)等。国际微生物学联合会(IAMS)还专门设立了世界菌种保藏联合会(WFGC),用计算机储存世界上各保藏机构提供的菌种数据资料,可以通过国际互联网查询和索取,进行微生物菌种的交流、研究和使用。

生物的生长一般都需要一定的水分,适宜的温度和合适的营养,微生物也不例外。菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同,给微生物菌株以特定的条件,使其存活而得以延续。例如利用培养基或宿主对微生物菌株进行连续移种,或改变其所处的环境条件,例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等,今菌株的代谢水平降低,乃至完全停止,达到半休眠或完全休眠的状态,而在一定时间内得到保存,有的可保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。

(1)传代培养保藏

传代培养与培养物的直接使用密切相关,是进行微生物保藏的基本方法。常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针对不同的菌种而选择使用适宜的培养基,并在规定的时间内进行移种,以免由于菌株接种后不生长或超过时间不能接活,丧失微生物菌种。在琼脂斜面上保藏微生物的时间因菌种的不同而有较大差异,有些可保存数年,而有些仅数周。一般来说,通过降低培养物的代谢或防止培养基干燥,可延长传代保藏的保存时间。例如在菌株生长良好后,改用橡皮塞封口或在培养基表面覆盖液体石蜡,并放置低温保存;将一些菌的菌苔直接刮入蒸馏水或其他缓冲液后,密封置4℃保存,也可以大大提高某些菌的保藏时间及保藏效果,这种方法有时也被称为悬液保藏法。

由于菌种进行长期传代十分繁琐,容易污染,特别是会由于菌株的自发突变而导致菌种衰退,使菌株的形态、生理特性、代谢物的产量等发生变化,因此在一般情况下。在实验室里除了采用传代法对常用的菌种进行保存外,还必须根据条件采用其他方法,特别是对那些需要长期保存的菌种更是如此。

2)冷冻保藏

将微生物处于冷冻状态,使其代谢作用停止以达到保藏的目的。大多数微生物都能通过冷冻进行保存,细胞体积大者要比小者对低温更敏感,而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因是低温会使细胞内的水分形成冰晶,从而引起细胞,尤其是细胞膜的损伤。进行冷冻时,适当采取速冻的方法。可因产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时,冰晶又会长大,故快速升温也可减少对细胞的损伤。冷冻时的介质对细胞的损伤也有显著的影响。例如,0.5mol/L左右的甘油或二甲亚砜可透入细胞,并通过降低强烈的脱水作用而保护细胞;大分子物质如糊精、血清蛋白、脱脂牛奶或聚乙烯砒咯烷酮(PVP)虽不能透人细胞,但可通过与细胞表面结合的方式而防止细胞膜受冻伤。因此,在采用冷冻法保藏菌种时,一般应加入各种保护剂以提高培养物的存活率。

一般来说,保藏温度越低,保藏效果越好。在常用的冷冻保藏方法中,液氮保藏可达到-196℃。因此,从适用的微生物范围、存活期限、性状的稳定性等方面来看,该方法在迄今使用的各种微生物保藏方法中是较理想的一种。但液氮保藏需使用专用器具,一般仅适合一些专业保藏机构采用。与此相应,冰箱保藏使用更为普遍。在各种基因工程手册中,一般都推荐在-70℃低温冰箱中保存菌株或细胞的某些特殊生理状态(添加甘油做保护剂),例如经诱导建立了感受态的细胞。在没有低温冰箱的条件下,也可利用-20—-30℃的普通冰箱冷冻室保存菌种。但应注意加有保护剂的细胞混合物的共融点处在这个温度范围内,常会由于冰箱可能产生的微小温度变化引起培养物的反复融化和再结晶,而对菌体形成强烈的损伤。因此采用普通冰箱冷冻保存菌种的效果往往远低于低温冰箱,应注意经常检查保藏物的存活情况,随时转种。

(3)干燥保藏法

水分对各种生化反应和一切生命活动至关重要,因此,干燥,尤其是深度干燥是微生物保藏技术中另一项经常采用的手段。

沙土管保存和冷冻真空干燥保藏是最常用的二项微生物干燥保藏技术。前者主要适用于产孢子的微生物,如芽孢杆菌、放线菌等。一般将菌种接种至斜面,培养至长出大量的孢子后,洗下孢子制备孢子悬液,加入无菌的沙土试管中,减压干燥,直至将水分拍干,最后用石蜡、胶塞等封闭管口,置冰箱保存。此法简便易行,并可以将微生物保藏较长时间,适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。

冷冻真空干燥保藏是将加有保护剂的细胞样品预先冷冻,使其冻结,然后在真空下通过冰的升华作用除去水分。达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存,从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态,生命活动处于休眠,可以达到长期保藏的目的。用冰升华的方式除去水分,手段比较温和,细胞受损伤的程度相对较小,存活率及保藏效果均不错,而且经抽真空封闭的菌种安领管的保存、邮寄、使用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍,也是最重要的微生物保藏方法,大多数专业的菌种保藏机构均采用此法作为主要的微生物保存手段。

除上述方法外,各种微生物菌种保藏的方法还有很多,如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。由于微生物的多样性,不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性,迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此,在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微生物菌株,则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏,以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。

二、水分及可给性

1、水的可给性:常以水活度值(water activity, aw)表示。

水活度值是指在一定的温度和压力条件下,溶液的蒸气压力与同样条件下纯水蒸气压力之比,即aw=Pw/P0w式中Pw代表溶液蒸气压力,P0w代表纯水蒸气压力。

微生物一般在aw为0.60-0.99的条件下生长,aw过低时,微生物生长的迟缓期延长,比生长速率和总生长量减少。

微生物不同,其生长的最适aw不同。一般而言,细菌生长最适aw较酵母菌和霉菌高,而嗜盐微生物生长最适aw则较低。

几类微生物生长最适aw

微生物

aw

微生物

aw

一般细菌

0.91

嗜盐细菌

0.76

酵母菌

0.88

嗜盐真菌

0.65

霉菌

0.80

嗜高渗酵母

0.60

2、渗透压

在微生物正常生长情况下,细胞内溶质的浓度高于细胞外溶质的浓度,所以水分能通过半透性的质膜进入细胞内,由于细胞壁的保护作用避免了因水分的无限流入造成的质膜破裂。而高渗环境会使细胞脱水、造成生理干燥,原生质收缩引起质壁分离现象,因而能抑制大多数微生物生长。(低渗溶液能破坏去壁的细胞原生质体。)

高渗环境防止食品腐败

盐渍:利用高浓度(常用10-15%)食盐人工造成高渗环境来保存食品,如腊肉;

糖渍:人工利用高浓度蔗糖(常用50-70%)造成高渗环境来保存食品eg..罐头。(该浓度具有杀菌效果)

3、氢离子浓度(PH

(1) 不同微生物生长PH范围

自然界中pH1-11都有微生物的生活,但只的少数种类能在pH2以下和pH10以上生长。大多数种类生活在pH4-9的环境中。每种微生物都有生长的最低、最适、最高pH。

一些微生物生长PH范围

微生物类型

pH范围

最适pH

大多数细菌、藻类和原生动物等

4-10

6.5-7.5

一般放线菌

5-10

7.5-8.4

一般酵母菌

3-8

4.0-5.8

一般霉菌

1.5-10

3.8-6.0

对微生物的作用机制:①影响细胞质膜电荷和养料的吸收;②影响酶的活性;③改变环境中养料的可给性或有害物质的毒性。

(2) 微生物培养过程中PH调节措施详见培养基制作中的pH的调节

三、氧气及氧化还原电位:

按照微生物与氧的关系,可将微生物分成(详见书104):好氧性微生物、厌氧性微生物(又称嫌气性微生物)、兼性厌氧微生物。

 

不同微生物的Eh

微生物类群

生长的Eh环境

适宜的Eh环境

好氧微生物

>+0.1

+0.3~+0.4

厌氧微生物

<+0.1

<-0.1

兼性厌氧微生物

>+0.1进行有氧呼吸

<-0.1进行发酵作用

举例:(兼性厌氧微生物)酒精发酵:先通气,获得大量菌体,再不通气生产代谢产物---酒精。 

四、辐射(自学,详见书105-106);紫外线辐射(UV)的应用

紫外线(实验室用得最多:低剂量的紫外线,会刺激微生物的生长;高剂量的紫外线,240-300nm的紫外线对微生物具有致死效应。其最强作用的波长是265-266nm,这是核酸的最大吸收波长。其杀菌机理主要在于可引起DNA分子中相邻的胸腺嘧啶(T)产生二聚体,进而引起微生物的突变或死亡。但紫外线的穿透力弱,实际工作中常用作空气或器皿表面灭菌和微生物的诱变育种。为避免光复活现象,紫外线照射灭菌后的分离培养工作须在红光或避光条件下进行。

光复活:在光照下光解酶转变紫外线诱导的胸腺嘧啶二聚体返回单聚体。在依赖于光的修复机制中,光解酶与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)能切割相邻嘧啶间的环丁烷环恢复为原来的单聚体。这是对付紫外线损伤的第一线防御。

切补修复〔暗修复〕:为把它与光复活作用区分开,切补修复常称为暗修复。它作为许多不同类型的DNA损伤修复的普遍系统,如嘧啶二聚体和错误碱基配对引起的DNA损伤。uvrA、B和C基因产物结合形成一个核酸内切酶,它能识别碱基改变所引起的DNA螺旋扭曲。uvrABC内切核酸酶在损伤的任何一边作一切口,DNA聚合酶I切除和替换损伤部位的碱基,DNA连接酶将缺口填补上。

1、可见光

光合微生物,如蓝细菌、藻类等;

非光合微生物:有的表现一定的趋光性。一些真菌在形成子实体和孢子时,也需要一些散射光的刺激。如:蘑菇和灵芝菌必须在散射光的照射下形成子实体。

2、、电离辐射:X射线、α射线、β射线和γ射线均为电离辐射。其共同特点是波长短、能量大、能使被照射物中水分子发生电离产生游离基能与细胞中的敏感蛋白分子作用使其失活,从而使细胞受到损伤或死亡。对不耐热的物()品杀菌。

五、化学杀菌剂和抑制剂(自学,详见书106-109

()、有机化合物

1、酚类:主要是损伤微生物细胞壁和细胞质膜,使酶钝化和蛋白质变性。是医学上普遍使用的一种消毒剂。如:苯酚(假借名义俗称石碳酸)等。

2、醇类:70-75%乙醇,纯的或高浓度的乙醇因能合菌体表面蛋白质凝固,不易渗透进入细胞,所以杀菌效果极小。对细菌芽孢和无包膜病毒的杀菌效果较差,所以长期使用的酒精溶液(包括70-75%的消毒酒精)中可能含有细菌芽孢,需经细菌过滤器或蒸馏除去。

3、醛类:能与蛋白质中氨基酸的多种基团(-NH2、-OH、-COOH和-SH等)共价结合而使基变性,达到杀菌的目的。其中福尔马林(37%-40%的甲醛水溶液)和戊二醛有较强的杀菌作用。

4、酸类:有机酸能抑制微生物(尤其是霉菌)的酶和代谢活性,常加在食品和饮料中以抑制霉菌等微生物的生长。山梨酸和苯甲酸常用作食品和饮料的防腐剂。

5、表面活性剂:具有杀菌作用,是由于他能吸附在微生物细胞的表面,改变了细胞的稳定性和透性,使细胞内的物质逸出膜外,引起微生物停滞或死亡。常用的具有表面活性剂性质的是新洁尔灭、杜灭芬等。

()、无机化合物

1、卤化物:杀菌效力:F>Cl>Br>I。其中碘和氯最常用。碘的杀菌机制可能是通过与细胞中酶和蛋白质中的酪氨酸结合而发挥作用,以细菌、真菌、病毒和芽孢均有较好的杀菌效果。

2、重金属及化合物:均具有很强的杀菌力,其中尢以Hg+、Ag+、和Cu2+最强。0.2%的HgCl2溶液是实验室常用表面菌剂。稀性重金属进入细胞后主要与酶可蛋白质上的-SH基结合而使之失活或变性达到杀菌目的。

3、氧化剂:通过对细胞成分的氧化作用产生杀菌效果。最常用的是高锰酸钾和过氧化氢。臭气是很强的氧化剂,但目前存在的问题是成本太高和有效期太短。

()、染色剂

带有阳离子电荷的碱基染色剂如结晶紫、亚甲基蓝、孔雀绿等都有抑制细菌生长的作用。其阳离子其团能与细胞蛋白质氨基酸上的羧基结合或核酸上的磷酸基结合,因而阻断了正常的细胞代谢过程。G+细菌一般对碱性染料敏感。结晶紫常用于抑制G+芽孢杆菌的生长。

复制此文】【打印此文】【关闭窗口】【字体:

 上一篇:电子讲义- 第五章 微生物的遗传与变异
 下一篇:电子讲义- 第三章 微生物的营养和产能代谢
 课程首页友情连接后台管理留言管理

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

可肤冰肌白 绿瘦商城 老苗汤 美国种玛 超级p57 p57 坐立瘦 博美堂左旋肉碱 绿瘦商城 谷德宝骨细胞修复液 可肤冰肌白 强力透骨膜 金骨宝细胞修复液 维纳斯精纯胶原蛋白 强力透骨膜 妙巢 波克城市官方下载